بررسی مسیر فعال سازی کسپاز به دنبال آپوپتوز القا شده با اسید رتینوئیک در سلول های بنیادی ماتریکس بندناف انسان

زمینه و هدف اسید رتینوئیک در بسیاری از فرایندهای بیولوژیکی مانند تکثیر، تمایز و مرگ سلولی نقش دارد. هدف از تحقیق حاضر بررسی تاثیرات آپوپتوتیک اسید رتینوئیک بر سلول های بنیادی مزانشیمی ژله وارتون بند ناف انسانی، مطالعه مسیر فعال سازی کسپازها و گیرنده های درگیر در مسیر پیام رسانی اسید رتینوئیک بود. روش ها پس از جدا سازی سلول های بنیادی از ناحیه ژله وارتون بند ناف انسانی به روش کشت قطعه ای و ارزیابی نشانگرهای سطحی آنها با تکنیک های فلوسایتومتری و rt-pcr، منحنی رشد این سلول ها در پاساژهای اول تا پنجم تعیین و مدت زمان دو برابر شدن جمعیت آنها محاسبه شد. جهت بررسی اثرات آپوپتوتیک اسید رتینوئیک، سلول های پاساژ دوم به دو گروه با کشت اولیه 24 و 72 ساعت تقسیم شدند و هر کدام از این گروه ها چهار و شش روز تحت تاثیر غلظت های مختلف این ماده قرار گرفتند. همچنین تاثیر اسید رتینوئیک در پاساژهای مختلف و با تعداد متفاوتی از سلولهای بنیادی بررسی شد و در نهایت، میزان حیات سلول های بنیادی تیمار شده با اسید رتینوئیک به روش mttارزیابی گردید. سپس ویژگی های مورفولوژیکی سلول های آپوپتوتیک با رنگ آمیزی eb/ao و dapi و بیان ژن های دخیل در اپوپتوز و گیرنده های اسید رتینوئیک به روش rt-pcr مورد بررسی قرار گرفت. نتایج سلول های بنیادی ژله وارتون در پاساژهای اول و دوم نسبت به پاساژهای سوم تا پنجم فاز سازش کوتاهتر و pdt کمتری داشتند. در سلولهای گروه کشت 24 ساعت، میانگین درصد حیات سلول هایی که تحت تیمار با اسید رتینوئیک قرار گرفته اند به صورت وابسته به غلظت کاهش یافت؛ اما مهار 50 درصدی حاصل نشد. در همین گروه با افزایش مدت زمان تیمار از چهار روز به شش روز نیز نتایج مشابهی حاصل شد. در گروه 72 ساعت کشت، اسید رتینوئیک تاثیر بیشتری نشان داد و در غلظت 7-10 مولار میانگین درصد حیات سلولها به 44% تقلیل یافت. افزایش تعداد زمان تیمار این سلول ها از چهار روز به شش روز نشان داد که این سلول ها نسبت به محدوده غلظت های فیزیولوژیکی اسید رتینوئیک (8-10- 10-10مولار) حساسیت بیشتری دارند و بیشترین حساسیت در سلول های پاساژ دوم با تعداد 1000 سلول در هر چاهک مشاهده شد. رنگ آمیزی های eb/ao و dapi سیتوپلاسم حباب دار و هسته های آپوپتوتیک را در سلولهای تیمار شده با اسید رتینوئیک را نشان داد. آنالیز rt-pcr افزایش بیان ژن های گیرنده اسید رتینوئیک (rar? و rar?) و نیز ژن های دخیل در آپوپتوز (caspase3،caspase8 ، caspase9 و bax) و کاهش بیان ژن ضد آپوپتوزی (bcl-2) را در سلول های تیمار شده با غلظت 7-10مولار اسید رتینوئیک به اثبات رساند. نتیجه گیری سلول های بنیادی مزانشیمی ژله وارتون پاساژ دوم در فاز تکثیری رشد خود تحت تاثیر غلظت های 7-10 تا 5-10 مولار اسید رتینوئیک دچار آپوپتوز شدید شده و ژن های دخیل در آپوپتوز در آنها بیان می شوند. این اثر آپوپتوتیک اسید رتینوئیک توأم با افزایش سطح بیان گیرنده های آن در سلول های بنیادی ژله وارتون می باشد.